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基因組DNA的快速純化方法
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-18 點(diǎn)擊次數(shù)： 1915次材料與儀器
尾部緩沖液 蛋白酶 K
離心管 玻璃棒步驟
第 1 天
1. 大約 1.5 cm 長(zhǎng)的尾部活檢樣品放在一個(gè) 1.5 ml 盛有 0.7 ml 尾部緩沖液的小離心管中，加 35 ul 10 mg/ml 蛋白酶 K，在 55℃ 振搖溫育過(guò)夜。
尾部緩沖液（配 25 ml）
50 mmol/L Tris，pH 8 1.25 ml 1 mol/L Tris，pH 8
100 mmol/L EDTA，pH8 5 ml 0.5 mol/L EDTA，pH 8
100 mmol/L NaCI 0.5 ml 5 mol/L NaCI
1% SDS 1.25 ml 20% SDS
存放于室溫。
蛋白酶 K：10 mg/ml 水溶液，貯存于 -20℃。
第 2 天
2. 加 7 ul 10 mg/ml RNA 酶（不含 DNA 酶），在 37℃ 孵育 1~2 小時(shí)。
3. 在微量離心機(jī)中對(duì)樣品離心 20 分鐘以沉淀鼠毛。
4. 小心轉(zhuǎn)移 0.5 ml 上清，注意不要攪動(dòng)沉淀。
5. 在管子中加 0.5 ml 異丙醇并通過(guò)翻轉(zhuǎn)輕輕地進(jìn)行混合。應(yīng)該立即有線狀沉淀形成。
不要?jiǎng)×一旌?。不要?DNA 形成緊密團(tuán)塊，否則會(huì)難以繞纏。
6. 在 Bunsen 燈的火焰上加熱封閉 100 ul 玻璃小吸管的末端。
7. 把末端封閉的小吸管浸到 DNA 溶液中并劇烈攪拌來(lái)纏繞 DNA。一直攪動(dòng)吸管直到 DNA 緊緊地纏繞到上面。
8. 洗 DNA 是在三個(gè)順序排列的盛大約 50 ml 乙醇的燒杯中各浸 10 次（1 個(gè)是 70% 乙醇，另 2 個(gè)是 100% 乙醇）。洗 5~8 個(gè)樣品后換洗滌溶液。
9. 用一片膠帶標(biāo)記玻棒末端，把它插在（DNA 端朝上）一塊橡皮泥，使風(fēng)干 10~15 分鐘。
10. 用鉆石記號(hào)筆在黏附了 DNA 的那一末端刻線，弄斷玻棒，把帶 DNA 的那段放到已作標(biāo)記的微量離心管中。
11. 加 0.5 ml TE ( pH 8 )。樣品在室溫下振蕩過(guò)夜。
第 3 天
12. 稍稍振蕩管子，用干凈鑷子拿掉玻璃棒（在不同樣品的操作之間燒一下鑷子）： 繼續(xù)振搖 1~2 小時(shí)。（如果樣品只是用來(lái)進(jìn)行 PCR 分析，玻棒可以留在管子里）。
13. 以 1:10 稀釋樣品，測(cè) OD260 值以確定濃度（1 OD260=50 ug/ml).
14. DNA 貯存在 4℃。
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