一．RAW264.7細(xì)胞背景介紹
細(xì)胞取材于Abelson小鼠白血病病毒誘發(fā)的腫瘤組織，是科研上尤為常用的炎癥細(xì)胞模型之一。該細(xì)胞易于增殖，有高效DNA轉(zhuǎn)染力，對RNA干擾敏感，常用作轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和復(fù)制小鼠諾如病毒。細(xì)胞有sIg-、Ia-、Thy-1.2抗原陰性。據(jù)報道，該細(xì)胞建系后已不分泌且檢測不到病毒顆粒，XC斑點形成實驗陰性。可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞，LPS或PPD處理2天后可誘導(dǎo)分解紅血球但對腫瘤靶細(xì)胞無作用。
二．RAW264.7細(xì)胞形態(tài)特征
1、RAW264.7細(xì)胞一般為圓形或橢圓形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，染色較深。貼壁特別牢固。若細(xì)胞呈多角形時，細(xì)胞為激活狀態(tài)。
2、RAW264.7具有吞噬能力，當(dāng)細(xì)胞吞噬抗原后，細(xì)胞會釋放趨化因子，進一步促進細(xì)胞伸出偽足，增強粘附攀爬能力。若細(xì)胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣，細(xì)胞剛傳完代比較稀疏的時候，都會讓該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長梭形，鏡下會看到具有細(xì)長偽足的小細(xì)胞被類似上皮的梭形細(xì)胞。
3、這個細(xì)胞屬于慢熱型的，很難消化，消化時間不夠則導(dǎo)致細(xì)胞無法消化下來，消化時間太長，傳代之后就會長個角給你看看，使勁吹打和細(xì)胞刀刮下來，則傳代之后不只是長個角給您看看了，還會飄起很多小黑點，而且這種細(xì)胞傳代時接種密度要大，否則也容易使巨噬細(xì)胞分化，細(xì)胞變形，并且不能恢復(fù)，這是培養(yǎng)這種細(xì)胞時最需要注意的問題。
4、RAW264.7細(xì)胞生長時喜歡結(jié)伴。正常生長狀態(tài)應(yīng)該是一小片一小片的生長，片片之間不連接，等到長到更多更密的時候會連成大片，并疊加成層。疊加成層的細(xì)胞需要更多的營養(yǎng)，一旦營養(yǎng)跟不上，細(xì)胞也會長個角給你瞅瞅，所以需要在細(xì)胞疊加的時候進行操作。
5、RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁迅速，半小時就能貼上一大片，剛貼壁是細(xì)胞呈圓形，折光度很好，鏡下觀察如小珍珠狀一個個地散落于瓶底面。若這個時候覺得活化的細(xì)胞較多，即長梭形的細(xì)胞較多時，可在細(xì)胞傳代消化重新貼壁半小時后進行換液，只保留生長狀況較好的細(xì)胞。
6、RAW264.7細(xì)胞的生長對血清要求比較高，血清不好會導(dǎo)致細(xì)胞生長情況變差。這是一個大胃王，所以在看到培養(yǎng)基變黃的時候不要遲疑，立馬換液處理。
1、培養(yǎng)之前，一切與細(xì)胞接觸的玻璃器皿和器具都要進行熱源處理。（200-250℃烘烤4-6h）
我們的消化及傳代方法：
方法一、消化液：0.5%胰酶、0.2EDTA，實驗前加溫到37℃以T25培養(yǎng)瓶為例：
1、細(xì)胞貼壁生長，長滿瓶底的95%時，棄去培養(yǎng)液，加D-HANKS漂洗兩次；
2、加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml，消化37℃約2-5min，鏡下可看見細(xì)胞基本脫落即終止消化，收集消化后的細(xì)胞；（因為底層的細(xì)胞一般長有偽足，它緊緊的貼在瓶壁上，更難消化，消化時可先收集上層細(xì)胞，然后再消化底層細(xì)胞，每次消化下來的細(xì)胞不能放在同一瓶里）。
3、加入D-HANKS漂洗兩次，加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml，37℃消化約2-5min，繼續(xù)消化底層的細(xì)胞，鏡下可看見細(xì)胞基本脫落即終止消化，單獨收集消化后的細(xì)胞；
4、加入新培養(yǎng)液10ML輕輕彈散混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶中，37℃CO2培養(yǎng)箱，幾小時后即可貼壁。
四、凍存的注意事項：
1、RAW264.7的凍存過程應(yīng)盡量減少熱源對細(xì)胞的影響，這樣對細(xì)胞種子的潔凈度有更好的保障。
2、這種細(xì)胞對空間狀態(tài)很敏感，所以復(fù)蘇的細(xì)胞密度或復(fù)蘇細(xì)胞數(shù)量控制在10^4-10^5為宜，這種接種密度接種在75cm2培養(yǎng)瓶中養(yǎng)2天后細(xì)胞密度即可到達70-80%，若細(xì)胞在復(fù)蘇的時候有偽足，先讓細(xì)胞生長到堆疊起來，然后再進行傳代，底部細(xì)胞棄掉，盡量選擇好的血清培養(yǎng)，可讓新生細(xì)胞慢慢達到未激活狀態(tài)。
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