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一氧化氮合酶組化顯示法
發(fā)布時間： 2023-01-13 點(diǎn)擊次數(shù)： 1474次簡介
細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀。
原理
一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本原理是細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位。
材料與儀器
器材：
染色缸、載玻片、蓋片、24孔板、毛筆、解剖器材、灌注器材、冰凍切片機(jī)、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠。
試劑：
①孵育液（NADPH、NBT）（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ；硝基四氮唑藍(lán)(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;②0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（PB）（磷酸二氫鈉（NaH2PO4•2H2O），3 g ；磷酸氫二鈉（Na2HPO4•12H2O），29 g ；加少量蒸餾水，調(diào) pH 7.2～7.4，最后定容至1000 mL ）;
③1％Triton X-100。④3％Triton X-100⑤1％中性紅⑥梯度乙醇⑦0.01 mol ／ L PBS⑧4％多聚甲醛⑨中性樹膠步驟
一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本過程可分為如下幾步：
（一）腦組織冰凍切片
A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，浸30％蔗糖后行冰凍切片（片厚40 μm ）。B．將切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ，重復(fù)3 次 。C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中，室溫，預(yù)浸60 min 。D．浸入孵育液中孵育，37 ℃ ，3 h 。E．3％Triton X-100,4 ℃ ，過夜。F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。G．裱片，風(fēng)干。中性紅復(fù)染。H．常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。（二）細(xì)胞爬片或甩片
A．細(xì)胞爬片或甩片，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ，重復(fù)3 次 。D．按上述腦組織冰凍切片步驟（3）～（6）操作。E．中性紅復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。注意事項(xiàng)
1．冰凍切片采用的是漂浮法，有利于孵育液充分進(jìn)入組織。2．本方法屬于酶組化，要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉颓‘?dāng)?shù)墓潭〞r間和方法，否則會影響酶的活性。3．此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果，降低非特異性背景染色。但 Triton X-100 預(yù)浸時間不能超過2 h ，孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2％，否則影響著色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 難溶。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅持為生命科學(xué)研究、活體動物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無動物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對細(xì)胞無毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
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