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    Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染

    發(fā)布時間: 2024-04-23  點擊次數(shù): 1506次

    轉(zhuǎn)染是實驗過程中常用的技術(shù)操作,通俗來說,常見的轉(zhuǎn)染即為把某種功能性質(zhì)粒轉(zhuǎn)到細胞中去,通過轉(zhuǎn)染試劑的作用在經(jīng)過一段時間后,收集細胞通過WB、qpcr等來檢測質(zhì)粒是否正常發(fā)揮作用來達到我們實驗的某種需求;不同的質(zhì)粒通常有不同的轉(zhuǎn)染試劑和不同的方法,如PEI轉(zhuǎn)染、lipo2000轉(zhuǎn)染等。

    Lipofectmine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 雙鏈體轉(zhuǎn)染使用,具有轉(zhuǎn)染效率高、對細胞毒性小等優(yōu)點,分為正向轉(zhuǎn)染及反向轉(zhuǎn)染兩種方式。siRNA轉(zhuǎn)染比較常見,因此本文分享主要針對siRNA反向轉(zhuǎn)染。


    轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備

    1.準(zhǔn)備試劑包括:Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA、不加雙抗的10%FBS培養(yǎng)基、胰酶、PBS緩沖液等常見處理細胞的試劑。

    2.反向轉(zhuǎn)染要求細胞密度≥90%。

    轉(zhuǎn)染中

    1.按正常處理細胞的流程將長滿的細胞經(jīng)過胰酶消化離心后去上清,注意此處需要加無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基1ml進行細胞重懸,重懸完后根據(jù)細胞生長速度鋪細胞,保證轉(zhuǎn)染完后24h細胞密度達到30-50%。

    2.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備:根據(jù)說明書制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,添加量如下表所示。

    Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染

    根據(jù)轉(zhuǎn)染的實際情況將Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA依次加入到一個無菌Ep管中,按照先加Opti-MEM培養(yǎng)基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX試劑的順序,輕輕混勻室溫孵育20min。

    3.20min后依次將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)皿種,輕輕混勻,放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

    轉(zhuǎn)染后

    1.轉(zhuǎn)染后24h內(nèi)最好不要挪動細胞,也不要拿出在顯微鏡下觀察,期間也無需進行細胞換液

    2.轉(zhuǎn)染后48h后,可拿出細胞觀察細胞形態(tài)有無變圓,肉眼觀察轉(zhuǎn)染效率,對于生長較慢的細胞,其表型可能會在72h內(nèi)逐漸顯現(xiàn)。根據(jù)細胞生長情況可進行換液,注意此時需要換含雙抗的血清培養(yǎng)基。

    3.在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),若細胞變圓較為厲害,應(yīng)在轉(zhuǎn)染后4天左右收細胞進行轉(zhuǎn)染效率測定,時間太久細胞太少的話檢測難度較大。

    4.此種轉(zhuǎn)染方式最長可維持5-7天的基因敲除效果。

    注意事項

    1. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑在冰箱4℃保存,切記不能冷凍。

    2. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑不宜在室溫放置過久,因此在制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物前從冰箱拿出,加完后應(yīng)立即放回4℃再進行后續(xù)操作。

    3.轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成后室溫孵育時間不得超過20min,因此建議將細胞鋪好板后十字混勻,暫放于細胞培養(yǎng)箱內(nèi),再進行轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備。

    4.siRNA應(yīng)于-80℃保存。

    5.在處理細胞重懸時一定要使用無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基,避免細胞死亡,如果在鋪板后還要進行細胞傳代也沒有影響,直接用上述混懸液傳代即可。

    6. Lipofectamine ™ RNAiMAX轉(zhuǎn)染的兩種方式差別不是很大,主要區(qū)別在于正向轉(zhuǎn)染需要提前一天進行細胞鋪板,第二天直接加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物,同時還需要在轉(zhuǎn)染后4-6h進行細胞換液。反向轉(zhuǎn)染速度比正向轉(zhuǎn)染更快,操作較為簡潔,因此更建議使用反向轉(zhuǎn)染。

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