-
分子克隆實驗的流程及注意事項--二、TOPO克隆
發布時間： 2025-03-18 點擊次數： 883次二、TOPO克隆
引物設計與PCR擴增
1. 目的片段 PCR 擴增引物合成時，要求引物 5’端不可磷酸化修飾；2. 建議使用高保真酶進行目的片段的 PCR 擴增，并摸索退火溫度，優化反應體系和程序。
PCR產物的純化回收
1.PCR 反應后，產物應當進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；2.推薦使用切膠回收的方式純化 ( 切膠時間最好控制在 3min 內，避免紫外照射對 DNA 的損傷 )，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，濃度應當≥ 30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；
3.回收濃度低時，可通過增加 PCR 反應體系，采取多管反應單管回收的方式，提高回收產物的濃度。目的片段連接至載體
1.連接反應體系按照說明書要求投入，各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過高可稀釋后使用；
2.連接反應溫度可嘗試 25°C或 37°C，時間 5min，若不長克隆或克隆空載體 / 假陽性，時間可嘗試延長至 30min；
3.連接反應建議在 PCR 儀中進行。感受態轉化涂板
1.連接產物轉化的感受態細胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學感受態細胞；
2.感受態細胞不可反復凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；
3.重組產物體積與感受態細胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產物加入至 100μl 感受態細胞或 5μl 重組產物加入至 50μl 感受態細胞；
4.熱激時間：按照感受態細胞說明書操作進行；
5.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉化的載體抗性需保持一致；
6.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養基，保留100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。
單克隆菌落PCR鑒定
1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過大或過小的單克隆菌落；
2.挑取數個單克隆菌落進行鑒定分析；
3.挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為PCR 反應（10/20μl 體系）模板；
4.推薦使用一對分別位于片段和載體的上下游引物進行 PCR 鑒定。
常見問題分析：
不長克隆
1. 片段類型錯誤：只兼容 PCR 擴增產物，且引物 5’端不可磷酸化修飾；
2. 片段投入不符合要求：片段應當切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系各組分投入體積不小于 1μl；片段投入量應按照說明書公式計算；
3. 連接反應不適當：反應應在 PCR 儀中進行，溫度可設置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min。
空載體 / 假陽性
1. PCR 擴增產物不單一：優化 PCR 體系，提高特異性；對目的片段切膠回收；鑒定更多單克隆；
2. 片段投入不符合要求：片段應當切膠回收，且回收濃度不低于 30ng/μl；濃度過高時需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl；片段投入量應按照說明書公式計算；
3. 連接反應不適當：反應應在 PCR 儀中進行，溫度可設置 25 或 37°C，連接時間可從 5min延長至 30min；
4. 菌液 PCR 用酶不適合：PCR 酶活應當不受雜質影響，引物不應選擇插入片段 PCR 用引物進行檢測。
測序突變
1. 測序克隆數過少：測序單克隆數只有 1 個時，測序信息部分可信，建議多測幾個單克隆，檢查突變處的測序信號是否有問題，突變是否從模板引入；
2. 突變位置：若堿基突變位于引物處，建議重新合成引物再次實驗；位于其他部位的突變，應當使用高保真酶重新制備模板再次實驗。
測序片段不正確
1. PCR 擴增產物不單一：優化 PCR 體系，提高特異性；對目的片段切膠回收；鑒定更多單克隆；2. 模板存在 Amp/kana 抗性的質粒：對目的片段進行切膠回收。
安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務
銷售熱線
