細胞死亡

動物細胞的死亡主要有三種方式：細胞凋亡、細胞壞死和細胞自噬。目前對動物細胞凋亡的特征、機制和生物學功能的研究較為深入。

細胞凋亡也被稱為程序性細胞死亡  (programmed cell Death,  PCD)  。PCD 最初是發育生物學中提出的概念,  其含義是發育過程中發生的某 類細胞的大量死亡,而這種細胞死亡要求特定的基因表達。細胞凋亡的典型特征是DNA規律性斷裂為 180-200bp整數倍的片段,并暴露出3'-OH 末端,  在瓊脂糖凝膠電泳時呈現有規律的梯狀條帶。

細胞壞死是區別于細胞凋亡的另一種典型死亡方式。當細胞受到意外損傷。如物理、化學因素或嚴重的病理性刺激的情況下細胞壞死才會發生。 此時細胞內 ATP 濃度下降,  細胞質出現空泡,  細胞質膜受損,  細胞內含物,  包括膨大和破碎的細胞器以及染色質片段釋放到胞外,   引起 周圍組織的炎癥反應。 與細胞凋亡不同,  細胞壞死過程中染色質不發生凝集 ,  也不產生有規律的 180-200 bp 的 DNA 降解片段,  而是被隨機降 解,  瓊脂糖凝膠電泳時呈現彌散性分布,  俗稱 u 拖尾 n 現象。

細胞凋亡

凋亡過程模式圖

1. 正常細胞 2.細胞凋亡的起始 3.凋亡中的細胞 4.凋亡小體被鄰近吞噬細胞吞噬

細胞凋亡檢測方式

細胞凋亡檢測有很多途徑和方式,  Annex in v 法早期凋亡檢測,  線粒體膜通透性變化檢測,  凋亡蛋白酶活力檢測,  TUNEL檢測,   DNA ladder 電泳檢測等等。目前應用范圍最大的是能夠對早期凋亡進行檢測的Annexin V法，和能夠區分壞死和凋亡細胞并特異性標記出細胞凋亡的TUNEL法。

A Annex in V檢測

檢測原理：

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內側翻向外側。這一改變被認為是特異性的，并且可作為凋亡細胞表面改變的標記。Annexin V是一類廣泛分布于真核細胞胞漿內的鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白，分子量為35~36KDa，能與細胞凋亡過程中外翻到膜外的PS高親和力特異性結合，被作為檢測細胞凋亡早期的靈敏指標之一。

以經典方法 Annex in V-FIT C/PI 為例。 用標記了 FITC 的 Annex in V 作為熒光探針,  再結合核酸染料碘化丙啶 (prop idi um  lodi de, PI ),  利 用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生,  并對凋亡細胞進行分群。  原理如下 :

FITC 標記的 Annex in V保留了與 PS 的高親和力,  Annex in  V-FIT C 染色可在凋亡早期就檢測到外翻的 PS,  識別出凋亡的發生。PI 是一種 核酸染料,  pl 不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜,  但可穿透膜損傷的細胞,  如晚期凋亡細胞或者壞死細胞的細胞膜并與其內的DNA結合，將細胞核染色，可用來區分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞或壞死細胞。

方法優勢:
Annex in V 法檢測細胞凋亡主要有三大優勢:

1）特異性標記早期凋亡細胞膜表面的PS，聯用核染料，對凋亡細胞進行分群和定量

2）精確反應細胞群體的凋亡趨勢

3）操作自由度高，發射波長不一致的情況下可兼容共染

數據展示

下圖使用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A211)進行凋亡檢測。使用不同濃度的喜樹堿（Camptothecin,CPT）誘導健康Jurket細胞（人T淋巴瘤細胞）凋亡，并同時做競爭封閉實驗，證明Annexin V-FITC的染色特異性。

結果表明，Annexin V法可以對凋亡細胞進行分群（左下角細胞為未凋亡細胞，右上角為晚期凋亡細胞）并且可以對不同程度的凋亡進行區分

                                                      Annexin V-FITC/PI 染色檢測不同程度凋亡

用喜樹堿CPT誘導Jurkat細胞凋亡，誘導濃度分別為0、4、8、12、16uM，分別誘導4h后，參照產品說明書實驗方案進行染色，用流式細胞儀檢測結果如圖，（A）0 uM.（B）4 uM.（C）8 uM.(D)12  uM.(E)16 uM.(F)競爭封閉實驗，采用16uM CPT誘導Jurkat細胞4h后，參照說明書收集并洗滌細胞，于染色前加入無燃料標記的Annexin V蛋白孵育10min,再進行Annexin V-FITC/PI染色。無染料標記的Annexin V結合了細胞上的PS，再進行染色時，Annexin V-FITC無法結合PS，這說明了染色的特異性。

B TUNEL法

檢測原理：

TUNEL 測定法是一種末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法。這一方法借助一種可觀測的標記物，如熒光素，能對凋亡細胞的核DNA中產生的3’-OH末端進行原位標記。使用熒光顯微鏡即可進行觀察。TUNEL法中，直接標記步驟少，操作簡便，間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高，是目前檢測細胞凋亡最為常用、最為普遍的檢測方法之一。

TUNEL 根據標記物的不同，可以分為熒光法和顯色法兩種，熒光法需要使用熒光顯微鏡進行觀察，主要顯示的是細胞核的狀態，顯色法使用普通光學顯微鏡即可進行觀察，更方便對組織細胞本身的情況進行觀察。

方法優勢：

1）特異性標記凋亡細胞，而不標記壞死細胞；

2）相對于Annexin V從細胞群體角度反映凋亡，TUNEL法更有利于觀察組織、細胞的整體凋亡狀態；

3）TUNEL法使用樣本更廣：石蠟切片、冰凍切片、貼壁細胞、懸浮細胞；

4）方法兼容度高，可以根據自身需求進行免疫組化、免疫熒光共染等操作；

數據展示

Hela細胞爬片（共染GAPDH）

使用DNase I 室溫處理10min后進行TUNEL染色

使用產品：TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit(Vazyme #A113)

A:DAPI B:TUNEL染色，標記凋亡細胞 C：GAPDH D：Merge

                                                           小鼠肝臟石蠟切片

使用產品：TUNEL Colorimetric Apoptosis Assay Kit(Vazyme #A114)進行染色

凋亡系列產品選購指南

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務